Масс-спектрометрия биологических жидкостей

Разработка технологии масс-спектрометрического экспресс-анализа жидких биологических проб и выпуск опытных образцов лазерного масс-спектрометра. Работа проводится при поддержке Федерального агентства по науке и инновациям. Государственный контракт №02.522.12.2012 от 01 октября 2009 г.

(Институт общей физики им. А.М.Прохорова РАН Институт аналитического приборостроения РАН ООО "Лаборатория оптико-электронных приборов" ООО "Инлайф" ЗАО "Аксиома-Сервис")

Актуальность проекта

Одной из основных задач, стоящих перед современной медициной, является проведение терапевтического лекарственного мониторинга в целях обеспечения оптимальной концентрации лекарственного средства в месте его действия. В первую очередь это касается антибиотиков, антиаритмических препаратов, антиконвульсантов и других препаратов, имеющих узкий терапевтический коридор (разницу между средней терапевтической и токсической дозами).

В России терапевтическому лекарственному мониторингу подлежат более пятидесяти веществ (приказ Минздрава России от 21 февраля 2000г. N 64). Знание терапевтического коридора во многих случаях облегчает задачи врача в выборе оптимальных схем применения лекарственного средства.

Простое измерение значений концентраций в крови пациента не всегда обеспечивает успешный результат, даже если речь идет о препарате, терапевтические рамки которого хорошо известны и можно по двум-трем измерениям рассчитать необходимую дозировку и интервалы дозирования. Для целого ряда лекарственных препаратов назначение так называемых средних доз без учета знания концентрации препарата в крови может приводить к непредсказуемым последствиям. Изменение концентрации лекарственного препарата в крови может быть вызвано взаимодействием с другими препаратами, пищей, депонированием в тканях, изменением метаболизма.

В связи с этим, своевременная информация об изменении концентрации лекарственного препарата в крови или в других жидких биологических пробах позволит лечащему врачу скорректировать терапевтическое лечение.

Терапевтический лекарственный мониторинг необходим в следующих ситуациях:

• при значительной межиндивидуальный вариации фармакокинетических параметров препарата, приводящей к существенным различиям в конкретных значениях стационарных концентраций в крови пациента (особенно важно внимательно относиться к фармакотерапии у детей, у которых имеются существенные различия в массе тела и скорости метаболизма, нельзя не учитывать и половые различия);
• при нелинейной кинетике препарата, когда нет прямой зависимости между дозой препарата и концентрацией препарата в крови в пределах терапевтического уровня;
• при очень узком терапевтическом коридоре (опасность получения нежелательных побочных и токсических проявлений);
• при специфическом контингенте пациентов (беременные и кормящие женщины, лица пожилого возраста, грудные дети и т.д.), у которых фармакокинетические параметры, а значит, и границы безопасного терапевтического коридора, значительно отличаются от обычных известных средних значений;
• при нарушениях функции почек, печени или желудочно-кишечного тракта, влияющих на фармакокинетические параметры;
• при политерапии, когда нельзя исключить взаимовлияния нескольких препаратов и трудно смоделировать процессы, приводящие к нормализации фармакокинетических параметров;
• при сомнении в регулярности приема препарата пациентом.

Основным способом регистрации фармакокинетики и проведения терапевтического лекарственного мониторинга является масс-спектрометрия – наиболее совершенный в настоящее время метод анализа состава вещества. Масс-спектрометры обладают высокой чувствительностью, динамическим диапазоном и разрешением. Это позволяет проводить, например, анализ примесей при их относительном содержании менее 10^-9, определять элементный и изотопный состав пробы с большой точностью.

Применение масс-спектрометрии в биохимии и затем в медицине, бурно развивающееся в последние два десятилетия, привело к революции в этих науках, а создание нового масс-спектрометрического метода анализа сложных биоорганических соединений посредством десорбции ионов из органической матрицы импульсным лазерным излучением (МАЛДИ) было отмечено Нобелевской премией по химии за 2002 год.

Важнейшей проблемой масс-спектрометрии сложных органических соединений является способ их ионизации, который должен обладать не только высокой эффективностью, но и селективностью по классам соединений и не приводить к существенной фрагментации анализируемых соединений.

На разработку способов ионизации органических соединений были затрачены значительные усилия, однако из всего их многообразия только два реально обеспечили возможность анализа жидкостей и используются в современных масс-спектрометрических комплексах:

1. образование ионов при распылении раствора анализируемого соединения в электрическом поле (электроспрей);
2. десорбция ионов из органической матрицы лазерным излучением (МАЛДИ).

При существенных технических различиях основы этих способов близки и заключаются в захвате протона молекулой органического соединения с образованием протонированного иона M+H⁺ (здесь М - молекула анализируемого вещества). В большинстве случаев энергия, полученная органической молекулой при таком способе ионизации, оказывается недостаточной для ее сильной фрагментации и в масс-спектре наблюдаются в основном протонированные ионы анализируемых соединений.

Схема ионизации способом электроспрей

Схема ионизации способом десорбции ионов из органической матрицы лазерным излучением (МАЛДИ)

Схема ионизации новым способом SALDI

SALDI: Surface Assisted Laser Desobtion Ionization, лазерная десорбция-ионизация при помощи поверхности

Анализируемая проба наносится на специально подготовленную поверхность кремния или углерода с последующей лазерной десорбцией ионов органических соединений и их масс-спектрометрическим анализом. Поскольку ионизация способом САЛДИ осуществляется в вакуумной камере масс-спектрометра и не сопровождается потерями аналитических ионов (характерно для ионизации электроспреем), общая чувствительность способа САЛДИ оказывается существенно выше, чем у электроспрея.

Ключевую роль для получения высокой эффективности ионизации САЛДИ играет способ приготовления активной поверхности. Как показали исследования для эффективной ионизации САЛДИ необходимо создать в приповерхностном слое исходно монокристаллической подложки высокую (более 10¹⁷ в см³) плотность структурных дефектов типа «оборванных связей». Именно эти дефекты являются эффективными акцепторами электронов, генерируемых при лазерном облучении поверхности, что и приводит к принципиальному изменению энергетики химической реакции передачи протона анализируемой молекуле на поверхности.

Лазерная десорбция ионов с шероховатых поверхностей (SALDI)

SEM и AFM изображения SALDI активных поверхностей

A – Аморфный кремний (РФ патент № 2285253, 2006)
B – Паровое травление Si (РФ патент №2007144944)
C – Анодное травление Si (РФ патент № 2217840, 2003)

САЛДИ масс-спектр следов тринитротолуола в воздухе

Достигнутый предел обнаружения составил 10 ppt. Это соответствует относительной концентрации тринитротолуола в атмосферном воздухе 10^-11.
ppt – particles per trillion, одна молекула на 10¹² молекул воздуха.

Интерфейс ввода пробы в масс-спектрометр SALDI

Для анализа жидких биологических проб способом САЛДИ разработан и создан специальный интерфейс ввода пробы в масс-спектрометр. При атмосферном давлении жидкая проба наносится на активную кремниевую поверхность, расположенную на вращающемся шаре. После поворота шара на 180° проба вводится в масс-спектрометр. Под действием лазерного излучения проба десорбируется и ионизуется. При этом важно, что лазерное излучение очищает и активирует поверхность, после чего она готова к нанесению новой пробы. В связи с тем, что камера, в которой вращается шар, оснащена уплотнениями, при вводе пробы в масс-спектрометр САЛДИ падения вакуума практически не происходит и для обеспечения функционирования прибора достаточно вакуумных насосов относительно невысокой мощности (производительность форвакуумного насоса – около 0,7 литров в секунду, производительность вакуумного насоса – около 200 литров в секунду).

Интерфейс ввода жидкостной биологической пробы в масс-спектрометр SALDI

Традиционный ввод жидкостной пробы методом электроспрей

При вводе жидкой пробы способом электроспрей камера не герметична. В связи с этим для работы такого масс-спектрометра требуются вакуумные насосы существенно большей мощности (производительность форвакуумного насоса – около 5 литров в секунду, производительность вакуумных насосов – около 250 и 500 литров в секунду).

Оптическая схема масс-спектрометра SALDI

Сканирование лазерного луча ООО «Номатех»
г. Томск

Лазер Nd:YAG с диодной накачкой и преобразованием частоты ООО «ЭЛС -94» г. Москва

• Длительность импульса 0.35 нс
• Частота повторения 500 Гц
• Энергия в импульсе (355 нм) - 80 мкДж

Mасс-анализатор – рефлектрон с ортогональным вводом ионов

• Диапазон регистрируемых масс m = 1-10000 Да;
• Разрешение по массам m/Δm = 6000;
• Точность определения массы δm 10^-5m;

Основные применения прибора для экспресс-анализа жидких биологических проб в медицине (терапевтический лекарственный мониторинг)

• барбитураты – фенобарбитал;
• производные бензодиазепина – диазепам, фенозепам, нитразепам, тофизопам;
• иминостильбены – карбамазепин;
• блокаторы кальциевых каналов – верапамил;
• бета-адреноблокаторы – атенолол, метопролол, небиволол, пропранолол;
• антиаритмические препараты – аймалин, лидокаин, прокаинамид.

Tofisopam (Грандаксин)

 

Нанесение вещества электроспреем MW 382

• Концентр. раствора 1 мкг/мл
• Поток растворителя 1 мкл/мин
• Поток вещества 1 нг/мин
• Время экспозиции 2 сек
• Нанесенное вещество 30 пг
• Выход ионов за скан 800 000 (25 и/фг)

Chloropyramine (Супрастин)

140 пикограмм в пробе (термоспрей)
291 аем – 500 000 ионов
246 аем - 5.5 10⁶ ионов
~50 ионов/фг

Carbamazepine в сыворотке крови

Преимущества масс-спектрометра SALDI

При регистрации фармакокинетики реализуются следующие преимущества способа САЛДИ:

• порог обнаружения по соединениям группы амфетаминов и тофизопаму – 0,1 пикограмм определяемого вещества в пробе, вводимой в прибор;
• высокая скорость детектирования – до 1 мин. на одну пробу;
• малый объем испытуемого образца – 1-10 мкл;
• возможность одновременного определения концентраций до 20 веществ в одной пробе.

Использование нового метода ионизации САЛДИ позволяет построить более простой, чувствительный и универсальный масс-спектрометр по сравнению с имеющимися на рынке зарубежными аналогами для анализа жидких биологических образцов и проведения лекарственного мониторинга.

Сравнительная таблица аналогов

Все проекты направления "Лазерные технологии"